山东美正生物科技有限公司

概述

适用范围 

适用于奶粉中添加泛酸（维生素B5）含量的定量分析。该试剂盒可进行96次测定。 

实验原理

泛酸（维生素B5）检测试剂盒采用微生物方法定量检测奶粉中添加泛酸的含量。微生物检测体系与规范保持一致。植物乳杆菌的生长离不开泛酸，其生长强度与样品中泛酸的含量有关，将含有植物乳杆菌的泛酸检测培养基、样品或标品加入到微孔中，37℃避光孵育，植物乳杆菌开始生长，直至泛酸被完全消耗，24小时完成孵育。采用酶标仪读取610-630nm或540-550nm下样品的浑浊度，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中泛酸含量。

检测步骤

1、标准品配制 

1）打开无菌水瓶盖：沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，然后打开瓶塞，将瓶塞内侧朝上放置。

2）打开泛酸钙标准品瓶盖，取xmL无菌水加入标准品瓶中（x值见标准品瓶包装标签），盖上瓶盖，振荡使标准品充分溶解，即为标准品工作液。

3）取6个无菌管（1.5或2.0mL），将标准品工作液按照说明书表格进行稀释。标准品必须现配现用。 

 *标注曲线中已经包含样品40倍的提取稀释倍数。 

2、检测培养基的配制 

1）打开培养基瓶盖，用无菌镊子取出干燥剂并丢弃。 

2）将10mL无菌水（必须取自试剂盒中）加入泛酸检测培养基瓶中，盖紧瓶盖，振荡混匀。 

3）保证瓶盖密闭的前体下，95℃水浴加热5min，然后快速冷却至室温（低于30℃）。 

4）使用0.22μm无菌滤膜过滤全部培养基，用15mL无菌离心管收集全部滤液。 

5）取出冻干菌株，沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，轻轻打开瓶塞，将瓶塞内侧朝上放置；向菌株瓶内加入1mL无菌水（必须取自试剂盒中），用移液枪吹打混匀，取其中的YmL（Y值见菌株包装瓶标签）加入过滤后的培养基中，振荡混匀，即为检测菌液（检测菌液须现配现用）。 

注：如果培养基在处理的过程中出现较大体积的损失时，加入的冻干菌株体积需要做相应比例的调整。为杜绝实验室污染，菌株瓶中剩余的菌再用瓶塞密封，及时清理出实验室或者高压灭菌处理；制备的检测菌液如有剩余，也需要及时清理出实验室或者高压灭菌处理。 

3、检测步骤

注：加入微孔板中的样品必须为无菌样品（使用试剂盒中提供的无菌水进行稀释）。 

1）取出所需数量的微孔条置于微孔架上，将剩余微孔板条放回铝箔袋中密封，2-8℃储存。 

2）依次将140μL标准品或样品、140μL检测菌液加入微孔中（用标准品或样品溶液润洗枪头），然后用粘胶薄膜盖好微孔条（揭开粘胶薄膜的保护层，用手或压舌板将粘胶薄膜压平，使其充分封闭微孔板条）。注:保证粘胶薄膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。 

3）在37℃培养箱中避光孵育24小时。 

4）轻轻来回颠倒混匀微孔板，使菌液充分混匀，然后用一只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手自右上方沿对角揭开粘胶薄膜，静置2min待气泡全部消去（较难消去的小气泡用移液枪吸出）后用酶标仪在610-630nm或540-550nm下测量浑浊度。 

注：孵育完成后，微孔板可在冰箱中保存的长时间为48h，然后用酶标仪读数。

注意事项

1）试剂盒应在2-8℃储存，产品过期后请勿使用。
2）加入微孔板中的样品必须无菌，样品稀释时必须使用试剂盒中提供的无菌水。样品提取后必须在无菌的环境中进行操作，且实验中需要的其他耗材也必须无菌。
3）检测培养基会刺激眼睛、皮肤和黏膜，应小心使用。
4）试验完成后必须按照规章对微孔条进行处理（如高压灭菌）。
5）为确定样品中是否存在抑制因素，应进行回收率测定。提取之前，向样品中加入已知浓度的泛酸溶液，回收率应约为80-120%。当回收率较低时，表明存在抑制因素，应增加样品稀释倍数以消除抑制因素的影响。