乳铁蛋白是人体重要的免疫蛋白之一，具有多样化的体内抑菌、免疫调节和各种生理功能，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力，抑制人体细胞的作用;能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。
乳铁蛋白典型的应用方式是作为营养强化剂添加到婴幼儿配方奶粉、酸奶等乳制品中，以强化提升免疫力和调整肠道菌群稳态的，同时有助于婴幼儿与预防感染，所以乳品中乳铁蛋白含量的检测也至关重要。
关于乳品中乳铁蛋白的检测，国家于2024年2月发布了GB 5009.299-2024食品中乳铁蛋白的测定的标准方法，该方法为高效液相色谱法，用于测定巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉以及乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量的测定。样品经磷酸缓冲盐溶液提取，肝素亲和柱净化，液相色谱-紫外检测器检测。
美正Robussil C4色谱柱，
助力乳铁蛋白的高效液相检测
乳铁蛋白的检测需要用到C4色谱柱，美正生物始终致力于为食品检测实验室的老师们提供完整的解决方案，我们于2024年5月上线了Robussil C4色谱柱，为乳铁蛋白的高效液相检测又提供了一大助力。
经过实验室验证，使用Robussil C4色谱柱检测乳铁蛋白，保留时间稳定，峰型良好，分离效果良好，配合美正肝素亲和柱，能够满足GB 5009.299-2024对乳品中乳铁蛋白的检测。以下为实验部分。
样品制备
样品提取
称取奶粉样品1 ~ 5 g（具体称样量根据样品中乳铁蛋白含量而定，使过柱的乳铁蛋白含量不超过柱容量），加入适量温热的（不超过50℃）磷酸盐缓冲液2，搅拌使样品溶解，再使样品冷却至室温，分次将样品转移至50 mL容量瓶中，并用磷酸盐缓冲液2定容至刻度，充分混匀后转移至50 mL离心管中，取出40 mL样品于4℃条件下10000 r/min离心8 min，上清液待净化。
样品净化
将肝素亲和柱在室温下回温至室温，取下下端堵头，将保护液放出，再用5 mL磷酸盐缓冲液2活化亲和柱，然后，量取待净化液10 mL上于亲和柱上，控制流速在1 ~ 3 mL/min，弃去流出液，用10 mL磷酸盐缓冲液2淋洗小柱，弃去流出液，将残留淋洗液用洗耳球轻轻挤干，再用5 mL磷酸盐缓冲液1洗脱，收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液1定容至5 mL，摇匀，用0.45 μm水相滤膜过滤，待测。
NO.2 色谱条件
色谱柱：Robussil C4，5 μm，4.6 × 250 mm ；
流动相：A 相-0.1%三氟乙酸水溶液（V/V），B相- 乙腈；
柱 温：30℃；
流 速：1 mL/min；
检测波长：280 nm；
进样量：50 µL；
梯度洗脱条件
NO.3实验结果
奶粉基质加标回收实验结果
（添加水平400 mg/kg，n = 3）
NO.4实验谱图
乳铁蛋白标准工作溶液色谱图
奶粉样品检测色谱图
乳铁蛋白标准曲线
NO.5结论
本实验参考GB 5009.299-2024标准，使用肝素亲和柱结合HPLC-UV的方法对添加水平为400 mg/kg的奶粉样品进行了检测。结果表明，使用肝素亲和柱对奶粉基质进行净化，乳铁蛋白回收率满足要求且变异系数小于20%。使用Robussil C4色谱柱对乳铁蛋白进行检测，峰型良好，保留时间稳定。说明肝素亲和柱和Robussil C4色谱柱的性能满足于GB 5009.299-2024标准方法，能够满足奶粉中乳铁蛋白的检测需求。
